Societatea contemporana se afla in mijlocul unei epidemii globale de diabet zaharat tip 2. Aceasta boala este caracterizata de concentratii patologic crescute de glucoza in sangele pacientilor datorita productiei, secretiei si utilizarii inadecvate a insulinei - hormonul principal care regleaza concentratia de glucoza serica. Ne propunem sa generam linii reporter stabile ce pot fi utilizate pentru cuantificarea insulinei secretate.
Societatea contemporana se afla in mijlocul unei epidemii globale de diabet zaharat tip 2. Aceasta boala este caracterizata de concentratii patologic crescute de glucoza in sangele pacientilor datorita productiei, secretiei si utilizarii inadecvate a insulinei - hormonul principal care regleaza concentratia de glucoza serica. Ne propunem sa generam linii reporter stabile ce pot fi utilizate pentru cuantificarea insulinei secretate. Deoarece nivelurile de glucoza sunt reglate si de alti hormoni (glucagonul si peptida asemanatoare acestuia GLP-1), am extins strategia aceasta si in vederea cuantificarii acestor hormoni. Timp de decenii monitorizarea secretiei de insulina s-a facut cu ajutorul kit-urilor Elisa sau cu metode radioimunologice (RIA). Aceste metode prezinta un numar mare de limitari, cum ar fi: specificitate si reproductibilitate reduse, pasi numerosi de realizare, un domeniu de sensibilitate limitat si un cost ridicat. In etapa 1 a proiectului 158PED/2017 am conceput si realizat componentele principale ale unei platforme de testare bazate pe luciferaza pentru insulina, glucagon si GLP-1. Esentiala a fost conceperea si producerea de plasmide ce codifica fuziuni intre o enzima luminiscenta (NanoLuc) si pre-pro-hormoni care, in urma procesarii intracelulare si a secretiei elibereaza luciferaza si hormoni in raport echimolecular. Prin masurarea ieftina si rapida a activitatii luciferazei obtinem o cuantificare a hormonului. In urma caracterizarii extensive a liniilor reporter generate (inclusiv prin monitorizarea secretiei de hormoni ca raspuns la diferiti secretagogi clasici) avem dezvoltat un sistem perfect pentru testarea bibliotecilor comerciale de compusi chimici. Ulterior am utilizat una din liniile reporter obtinute pentru a testa o biblioteca de compusi naturali. Am gasit astfel o serie de compusi care moduleaza, pozitiv sau negativ, secretia de insulina. Unul este cunoscut deja ca modulator (forskolin). Alti compusi sunt foarte putin studiati si prezinta interes pentru studiile noastre de dezvoltare tehnologica ulterioara. Liniile reporter create sunt utile si pentru investigarea proceselor si factorilor celulari responsabili pentru sinteza, maturarea si secretia hormonilor. Acestea sunt tinte potentiale de modulare a secretiei hormonilor. Astfel, am realizat experimente de cloning molecular in vederea conceperii unor plasmide utile in obtinerea unor linii knockout prin tehnologia CRISPR/Cas9. Proteinele alese ca tinta fac parte din familia PDI - enzime rezidente in lumenul reticulului endoplasmatic unde se matureaza hormonii. Plasmidele au fost testate cu succes in linia HEK293T. In concluzie, am dezvoltat o platforma robusta pentru descoperirea de noi medicamente anti diabetice dar si pentru studierea proceselor celulare fundamentale de sinteza, maturare si secretie a hormonilor implicati in metabolismul glucidic.
Researcher
PhD (2006), University of Bucharest postdoctoral studies (2006-2008) - Utrecht University, Ineke Braakman group, the Netherlands since 2009 researcher at the Institute of Biochemistry, Stefana's Petrescu laboratory Grants received as PI: 1) "Cellular mechanisms associated with endoplasmic reticulum in hypoxia. Implications for biomedical research. ". 2010, UEFISCDI, (PN-II-RU-TE-2010-0048) 2) "A robust platform for the discovery of anti-diabetic compounds". 2017, UEFISCDI, (PN-III-P2-2.1-PED-2016-1660) More...
2017
Figura 1. Celule 1.1B4 Control (A) si transfectate cu hINS-NanoLuc (B) marcate cu anticorpi pentru insulina (rosu) si PDI (verde). Insulina supraexprimata colocalizeaza partial cu PDI (ER marker). Marea majoritate a moleculelor de insulina se afla in proximitatea membranei, in vezicule de secretie.
2018
Figura 2. Celule 1.1B4-hINS-NanoLuc clona 7 au fost monitorizate din punct de vedere al secretiei de insulina prin masurarea activitatii NanoLuc (c) si prin Elisa (d).
Figura 3.
Figura 4. Celulele HEK293T au fost transfectate cu plasmidele ce contin secvente ghid 3.1, 3.2 (ce tintesc PDIA3) si 6.1 si 6.2 (ce tintesc PDIA6). Lizate obtinute din celule cultivate 48 de ore dupa transfectie si lizate de celule cultivate in mediu cu puromicina timp de 7 zile au fost migrate in gel de poliacrilamida si ulterior transferate pe membrane de nitroceluloza. Membranele au fost apoi decorate cu anticorpi specifici pentru PDIA3 si PDIA6. Se observa disparitia semnalului dat de proteina PDIA6 in celulele transfectate cu secventele ghid 6.1 si 6.2 si disparitia semnalului pentru proteina PDIA3 in celule transfectate cu secventa ghid 3.2 dar numai dupa aplicarea reactivului de selectie - puromicina. * reprezinta o proteina recunoscuta nescpecific de anticorpii pentru PDIA3.
Diseminare:
Poster intitulat "P5 has a dual role in the endoplasmic reticulum" la conferinta "13th ER and redox club meeting", Homburg, Germania, 26-29 aprilie 2017
| Echipa de cercetare: | Drd David Patriche Dr Rodica Badea Dr Petruta Alexandru Dr Gabriela Chiritoiu Dr Stefana Petrescu |
| Director de proiect: | Dr. Florentina Pena Cecetator Stiintific in cadrul grupului "Biologia Moleculara a Celulei" condus de Dr. Stefana Petrescu Institutul de Biochimie Splaiul Independentei 296, Bucuresti Email: pena@biochim.ro |
Romanian Academy