Beta version (currently under testing). If you would like to visit the old website, click here.

Platforma robusta pentru descoperirea de medicamente anti-diabetice

Platforma robusta pentru descoperirea de medicamente anti-diabetice 2016-2019
Acronym: PLATFORMDIAB
Project director: Florentina Pena

Societatea contemporana se afla in mijlocul unei epidemii globale de diabet zaharat tip 2. Aceasta boala este caracterizata de concentratii patologic crescute de glucoza in sangele pacientilor datorita productiei, secretiei si utilizarii inadecvate a insulinei - hormonul principal care regleaza concentratia de glucoza serica. Ne propunem sa generam linii reporter stabile ce pot fi utilizate pentru cuantificarea insulinei secretate.

Societatea contemporana se afla in mijlocul unei epidemii globale de diabet zaharat tip 2. Aceasta boala este caracterizata de concentratii patologic crescute de glucoza in sangele pacientilor datorita productiei, secretiei si utilizarii inadecvate a insulinei - hormonul principal care regleaza concentratia de glucoza serica. Ne propunem sa generam linii reporter stabile ce pot fi utilizate pentru cuantificarea insulinei secretate. Deoarece nivelurile de glucoza sunt reglate si de alti hormoni (glucagonul si peptida asemanatoare acestuia GLP-1), am extins strategia aceasta si in vederea cuantificarii acestor hormoni. Timp de decenii monitorizarea secretiei de insulina s-a facut cu ajutorul kit-urilor Elisa sau cu metode radioimunologice (RIA). Aceste metode prezinta un numar mare de limitari, cum ar fi: specificitate si reproductibilitate reduse, pasi numerosi de realizare, un domeniu de sensibilitate limitat si un cost ridicat. In etapa 1 a proiectului 158PED/2017 am conceput si realizat componentele principale ale unei platforme de testare bazate pe luciferaza pentru insulina, glucagon si GLP-1. Esentiala a fost conceperea si producerea de plasmide ce codifica fuziuni intre o enzima luminiscenta (NanoLuc) si pre-pro-hormoni care, in urma procesarii intracelulare si a secretiei elibereaza luciferaza si hormoni in raport echimolecular. Prin masurarea ieftina si rapida a activitatii luciferazei obtinem o cuantificare a hormonului. In urma caracterizarii extensive a liniilor reporter generate (inclusiv prin monitorizarea secretiei de hormoni ca raspuns la diferiti secretagogi clasici) avem dezvoltat un sistem perfect pentru testarea bibliotecilor comerciale de compusi chimici. Ulterior am utilizat una din liniile reporter obtinute pentru a testa o biblioteca de compusi naturali. Am gasit astfel o serie de compusi care moduleaza, pozitiv sau negativ, secretia de insulina. Unul este cunoscut deja ca modulator (forskolin). Alti compusi sunt foarte putin studiati si prezinta interes pentru studiile noastre de dezvoltare tehnologica ulterioara. Liniile reporter create sunt utile si pentru investigarea proceselor si factorilor celulari responsabili pentru sinteza, maturarea si secretia hormonilor. Acestea sunt tinte potentiale de modulare a secretiei hormonilor. Astfel, am realizat experimente de cloning molecular in vederea conceperii unor plasmide utile in obtinerea unor linii knockout prin tehnologia CRISPR/Cas9. Proteinele alese ca tinta fac parte din familia PDI - enzime rezidente in lumenul reticulului endoplasmatic unde se matureaza hormonii. Plasmidele au fost testate cu succes in linia HEK293T. In concluzie, am dezvoltat o platforma robusta pentru descoperirea de noi medicamente anti diabetice dar si pentru studierea proceselor celulare fundamentale de sinteza, maturare si secretie a hormonilor implicati in metabolismul glucidic.

  1. Producerea unor linii celulare reporter care permit cuantificarea rapida si ieftina a insulinei, glucagonului si/sau a GLP-1
  2. Testarea unor compusi chimici care moduleaza secretia de insulina, glucagonului si/sau a GLP-1.
  3. Identificarea si caracterizarea unor factori celulari implicati in expresia si secretia de insulina, a glucagonului si/sau a GLP-1.

2017

  1. Am obtinut prin cloning molecular trei constructi (plasmide) astfel incat sa permita expresia stabila a prohormonilor preproinsulina si preproglucagon sub forma fuzionata cu reporterul luminiscent NanoLuc
  2. Am obtinut diverse clone - linii celulare stabile care sintetizeaza/proceseaza/secreta insulina, glucagon si GLP1 in paralel cu enzima reporter NanoLuc. Aceste celule au fost caracterizate din punct de vedere al raspunsului la diversi secratagogi.
  3. Investigam in prezent efectul mai multor compusi din diverse biblioteci asupra secretiei hormonilor secretati de liniile celulare obtinute

Figura 1. Celule 1.1B4 Control (A) si transfectate cu hINS-NanoLuc (B) marcate cu anticorpi pentru insulina (rosu) si PDI (verde). Insulina supraexprimata colocalizeaza partial cu PDI (ER marker). Marea majoritate a moleculelor de insulina se afla in proximitatea membranei, in vezicule de secretie.

 

2018

  • Am realizat experimente de secretie in liniile reporter create si am masurat in paralel atat activitatea NanoLuc cat si cantitatea de hormoni secretati prin metoda Elisa. Figura 2 prezinta un experiment frumos in care se vede clar cum activitatea NanoLuc se suprapune peste cantitatea de insulina.

Figura 2. Celule 1.1B4-hINS-NanoLuc clona 7 au fost monitorizate din punct de vedere al secretiei de insulina prin masurarea activitatii NanoLuc (c) si prin Elisa (d).

  • Am testat o biblioteca de compusi chimici din punct de vedere al efectului avut asupra cantitatii de insulina secretata a fost un studiu in sine. Am ales sa testam o biblioteca de compusi naturali (care contine 173 de inhibitori) iar argumentele in favoarea acestei alegeri le expun mai jos. Astfel, am cumparat o biblioteca de compusi naturali de la Selleckem.

    Istoric privind, compusii naturali au reprezentat pentru companiile farmaceutice o comoara. Citand Natural Products Library Initiative din cadrul celebrului Institut de cercetare Scripps "din 1940 131 din 175 molecule mici (adica 74,8%) utilizate ca medicamente anticancer sunt molecule naturale ori inspirate din molecule naturale: 48,6% sunt naturale. Din 1981 pana in prezent 79 (80%) din 99 de molecule mici anticancer sunt produse naturale ori inspirate din cele naturale." Acest lucru este firesc, in natura receptorii si liganzii lor au co-evoluat pentru miliarde de ani.

    Din multitudinea de compusi testati am selectat compusi care cresc sau scad cantitatea de insulina secretata. In Figura 3 este prezentat un experiment cu cativa compusi.

Figura 3.

  • Am conceput plasmide prin tehnici de clonare moleculara pentru eliminarea (knockout) cu ajutorul tehnologiei CRISPR/Cas9 a unor proteine ce ar putea afecta (direct sau indirect) plierea insulinei, glucagonului sau a GLP-1. Plasmidele construite in cadrul proiectului au determinat deletia proteinelor PDIA2 si PDIA6 in celule HEK293T.

Figura 4. Celulele HEK293T au fost transfectate cu plasmidele ce contin secvente ghid 3.1, 3.2 (ce tintesc PDIA3) si 6.1 si 6.2 (ce tintesc PDIA6). Lizate obtinute din celule cultivate 48 de ore dupa transfectie si lizate de celule cultivate in mediu cu puromicina timp de 7 zile au fost migrate in gel de poliacrilamida si ulterior transferate pe membrane de nitroceluloza. Membranele au fost apoi decorate cu anticorpi specifici pentru PDIA3 si PDIA6. Se observa disparitia semnalului dat de proteina PDIA6 in celulele transfectate cu secventele ghid 6.1 si 6.2 si disparitia semnalului pentru proteina PDIA3 in celule transfectate cu secventa ghid 3.2 dar numai dupa aplicarea reactivului de selectie - puromicina. * reprezinta o proteina recunoscuta nescpecific de anticorpii pentru PDIA3.

 

Diseminare:

Poster intitulat "P5 has a dual role in the endoplasmic reticulum" la conferinta "13th ER and redox club meeting", Homburg, Germania, 26-29 aprilie 2017

Echipa de cercetare: Drd David Patriche
Dr Rodica Badea
Dr Petruta Alexandru
Dr Gabriela Chiritoiu
Dr Stefana Petrescu

Director de proiect: Dr. Florentina Pena
Cecetator Stiintific in cadrul grupului "Biologia Moleculara a Celulei" condus de Dr. Stefana Petrescu
Institutul de Biochimie
Splaiul Independentei 296, Bucuresti
Email: pena@biochim.ro